胃癌在全球范围内发病率和死亡率居第5位，在中国，胃癌的发病率和死亡率长期位于恶性肿瘤前列。其中腹膜转移（GCPM）是晚期胃癌较常见的转移形式之一，患者生存预后整体较差。近年来，随着局部治疗的发展，腹腔灌注化疗（IPC）逐渐成为改善腹膜转移患者预后的重要策略之一。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在单细胞层面刻画组织的细胞组成与转录特性，揭示细胞异质性与稀有亚群，适用于复杂肿瘤微环境解析。
鉴于转录组（bulk RNA-seq）在差异基因识别与通路富集上较好的效能，以及scRNA-seq在细胞类型与状态解析上的高分辨率，组合分析有望在细胞分类与通路富集之间取得合理的平衡，提升解析能力。
1.1 样本获取与数据来源
我们的研究纳入3例GCPM患者，采集IPC前后的腹腔灌洗液共6份样本用于bulk RNA分析；其中1例患者的2份样本同步用于scRNA-seq。患者信息及测序用途见表1（缺失项以NA标注）。
表1 IPC前后腹腔灌洗液样本与测序信息
bulk RNA-seq采用Illumina NovaSeq 6000平台进行双端150 bp测序，原始FASTQ数据使用nf−core/rnaseq（v3.11.2，默认参数）完成质量控制与预处理，并比对至GRCh38参考基因组。
1.2 bulk RNA−seq差异表达分析
在R 4.4.2环境下使用DESeq2（v1.40.2）进行差异基因分析，以P<0.05且|log2FC|>2为阈值筛选显著差异基因，并用EnhancedVolcano（v1.18.0）可视化。
1.3 bulk RNA-seq功能富集与免疫细胞去卷积
使用clusterProfiler（v4.8.3）分别对差异上调与下调基因进行富集分析，Hallmark基因集经msigdbr获取并用enricher进行富集；GO_BP使用enrichGO、KEGG使用enrichKEGG富集分析，仅保留Benjamini-Hochberg校正后的P值（adjusted P value，adjP）<0.05的通路。免疫去卷积采用CIBERSORT（v0.1.0）与LM22特征矩阵估计样本的相对细胞比例。
1.4 scRNA−seq数据处理
使用Seurat（v5.1.0）进行预处理。读入原始UMI计数矩阵后，保留在≥3个细胞中表达的基因；在细胞层面进行质控：剔除基因数（nFeature_RNA）<200或>6500、或线粒体基因比例>15%的细胞。为降低双/多胞干扰，采用DoubletFinder与scDblFinder交叉鉴定去除双胞/多胞，随后进行对数归一化与标准化。
1.5 降维聚类与细胞注释
以FindVariableFeatures选取高可变基因，进行主成分分析（PCA），并结合ElbowPlot确定用于聚类的主成分数。使用FindAllMarkers（Wilcoxon秩和检验，默认参数）获得各簇差异标志基因，结合典型标志与文献进行细胞类型注释。
1.6 基因集合打分
采用AUCell算法（AUC−based cell scoring, v1.28.0）对单细胞进行基因集活性评分，以反映相关生物过程的活跃程度。具体流程如下：（1）输入表达矩阵；（2）构建细胞内基因表达排序矩阵；（3）计算AUC活性分数；（4）结果整合。
1.7 组分分析
提取每个细胞的细胞类型与样本信息，在每个样本内，按细胞类型分组计数，并计算该类型的比例，将各样本各细胞类型的比例汇总为“样本×细胞类型”，用于后续比较与可视化。
1.8 细胞通讯分析
采用CellChat（v2.1.1）对单细胞转录组数据进行细胞通讯推断。按照CellChat推荐的标准流程完成通讯概率计算、通路层面通讯概率汇总与网络聚合，并分别以连接数与通讯强度表征不同细胞类群之间的通讯水平。网络中心性等拓扑指标由netAnalysis_computeCentrality计算，差异通讯的统计显著性通过置换检验获得，并采用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正，adjP<0.05判定为显著，通讯网络的关键结果通过netVisual_bubble与netVisual_circle进行可视化展示。
2.1 胃癌腹膜转移患者IPC前后bulk RNA−seq差异分析
我们研究纳入3例女性GCPM患者（均接受IPC，临床概况见表1）。对IPC前后的6份腹腔灌洗液样本进行bulk RNA−seq差异分析，以P<0.05且|log2FC|>2为阈值，共检出713个差异基因，IPC后高表达基因137个；低表达基因576个（图1（a））。基于差异基因的GO、KEGG和Hallmark富集分析显示（图1（b）），红色为IPC后高表达的通路，主要富集在免疫与炎症相关过程；蓝色为IPC前高表达的通路，主要富集基质重塑与血管生成相关过程。整体上，IPC后样本呈免疫效应相关特征，IPC前样本更突出组织重塑与血管生成信号。进一步采用CIBERSORT去卷积估计，样本总体以T细胞与髓系细胞为主，其中以单核为主的髓系类群占比50%以上（图1（c））。在本队列中，IPC后CD8+T细胞比例由7.6%升至11.5%，Tregs由7.2%降至5.0%，髓系中以单核为主的成分变化趋势较明显，由49.8%降至33.4%，细胞组成变化与通路富集趋势基本一致（图1（d））。
图1 GCPM患者IPC前后腹腔灌洗液bulk RNA−seq分析
2.2 胃癌腹膜转移患者IPC前后腹腔灌洗液scRNA-seq分析
为进一步在单细胞分辨率上验证并细化bulk RNA-seq分析，选取1例患者IPC前后配对腹腔灌洗液进行scRNA-seq分析，用于定位差异通路的细胞来源，并比较治疗前后细胞组成及状态。
经严格质量控制、整合及降维分析后，共获得13571个高质量细胞。基于典型标记基因进行注释，识别出5种主要细胞：髓系细胞、T细胞、NK细胞、B细胞与上皮细胞（图2（a）），细胞类群颜色与右侧注释颜色对应。采用Harmony进行批次效应校正后，不同来源的细胞在二维空间中均匀分布，表明校正效果良好（图2（b））。气泡图展示了各类细胞的特征基因表达，支持细胞注释的准确性（图2（c））。
比较IPC前后的细胞组成发现，IPC后免疫细胞占比上升，T细胞由28.7%增至38.0%（呈上升趋势），NK细胞由0.9%增至2.5%；同时，髓系细胞占比由70.0%降至57.8%（呈下降趋势），但B细胞与上皮细胞占比较低，变化幅度有限（图2（d））。
图2 GCPM患者IPC前后腹腔灌洗液细胞类型及比例
2.3 IPC后T细胞谱系变化与功能指征
为评估IPC对局部微环境中T细胞的影响，对T细胞进一步分亚群与注释，依据典型标志基因将其分为5个亚群（图3（a）和（b）），类群颜色与右侧注释颜色一致。标志基因与生物学特征一致（图3（c）），与既往报道一致。
对比IPC前后的细胞组成（图3（d）），观察到IPC后CD8_CTL和CD4_Tn升高，而CD4_Treg下降，这提示IPC可能提升CD8+T细胞的杀伤功能，同时减弱Treg的抑制作用。采用基于基因表达排名的AUCell算法对T细胞功能基因集进行单细胞活性评分，并在细胞亚群层面汇总比较，得分组间差异采用Wilcoxon秩和检验（图3（e））。
综上，IPC可能通过增加效应性CD8+T细胞的比例并增强其杀伤功能，同时，耗竭性和调节性T细胞亚群比例降低，提示了IPC可能有助于调节免疫抑制环境，增强免疫应答。
图3 T细胞亚群及功能分析
2.4 IPC与髓系抑制性特征减弱相关
为刻画髓系细胞功能，进行了单细胞层面的亚群解析与功能分析。聚类后共鉴定出4个亚群，类群颜色与图右侧标识一致（图4（a））。标志基因表达在对应亚群中高表达（图4（b））。AUCell基因集活性评分显示，各亚群在M1/M2极化、血管生成和吞噬作用等方面存在差异（图4（c））。各亚群M2得分均高于M1得分，提示GCPM腹腔微环境中的髓系类群可能整体以免疫抑制为主。
IPC后，髓系细胞在整体组成层面由70.0%下降至57.8%（图2（d））。在亚群功能层面，基于AUCell功能评分的组间比较采用Wilcoxon秩和检验，相关差异未达到统计学显著性，但呈现明确的趋势：血管生成评分下降而吞噬评分上升（图4（d））。上述趋势指向髓系介导的免疫抑制可能减弱，微环境可能向更有利于效应淋巴细胞发挥抗肿瘤作用的方向重塑。
图4 髓系细胞亚群及功能分析
2.5 IPC诱导免疫细胞通讯格局变化
为刻画IPC对全局细胞通讯的影响，比较了IPC前后通讯网络：IPC后不同谱系间的通讯强度整体增强，其中CD8_CTL与其他亚群通讯提升较为明显。具体而言，IPC后CD8_CTL指向其他亚群的通讯强度（图5（b））较IPC前增强（图5（a）），其他亚群指向CD8_CTL的通讯强度（图5（d））也较IPC前增强（图5（c）），且与髓系亚群之间的增加最明显。
进一步关注CD8_CTL与髓系亚群的互作，CD8_CTL作为sender时（图5（e）），IPC后与多个髓系亚群互作增强，与抑制过度炎症及促进巨噬细胞清除凋亡细胞相关；CCL4−CCR5轴，与效应T/NK细胞的募集与增效相关，支持抗肿瘤免疫的增强。作为receiver时（图5（f）），多条黏附和共刺激信号增强。
综上，趋化（CCL4−CCR5）与黏附/共刺激（NECTIN2−CD226）等信号的增强提示IPC可能促进了CD8_CTL的募集、驻留与功能维持（图5（e）和（f）），表明IPC后局部微环境可能得到一定程度上的免疫恢复。
图5 髓系亚群与CD8_CTL的细胞间通讯分析
GCPM是晚期胃癌常见的转移形式之一，整体预后不佳。IPC可降低复发风险并改善生存，但IPC前后腹腔微环境变化仍不清楚。基于IPC前后配对腹腔灌洗液，联合bulk RNA-seq与scRNA-seq，探讨GCPM患者IPC前后免疫微环境的变化。
bulk RNA结果显示，IPC后炎症−趋化与先天免疫相关基因如IL1B、IRAK2、NLRP3等上调，并富集于白细胞迁移的正向调控与趋化因子信号通路，提示IPC后炎症−趋化被激活，白细胞迁移与免疫招募能力增强。
scRNA-seq总体与bulk RNA结论一致：IPC后T/NK细胞比例上升，髓系比例下降。IPC后髓系比例下降，亚群分析显示巨噬亚群的M1/M2评分并非对立，符合其表型已由二分法演变为连续谱系模型。功能上，Mph_APOE与Mph_SELENOP在吞噬得分较高、血管生成得分较低，并在IPC后，血管生成评分下降与吞噬评分上升，可能提示髓系细胞由促血管生成/组织重塑相关程序向清除与抗原处理相关功能偏移，有利于减弱免疫抑制。与此同时，LXR−APOE轴可能通过削弱髓系免疫抑制限制先天免疫抑制，提示其具有可药理调控的“双重性”。
细胞通讯层面，IPC后CD8_CTL与髓系细胞互作增强，CCL4−CCR5与NECTIN2−CD226等免疫信号通路增强。上述通路的增强提示IPC可能促进免疫微环境功能恢复并提升细胞毒性反应。
总体而言，bulk与单细胞两个层面的结果在方向上具有一致性：炎症−趋化与先天免疫信号增强、效应T/NK成分与功能状态上调、Treg细胞及髓系抑制特征下降，并伴随趋化−共刺激相关通讯轴增强。
我们的研究以配对腹腔灌洗液样本开展多组学纵向分析，较为直接地揭示了IPC相关的“效应T细胞增强—髓系抑制减轻”的方向性变化，但亦存在以下局限性。第一，样本量有限，统计效能受限，部分观察结果仅能支持趋势性变化。第二，腹腔灌洗液作为腹膜生态位的替代样本，其细胞组成可能受个体差异及灌洗回收效率等因素影响。第三，IPC后取样时间窗口相对靠近治疗实施，可能主要反映早期免疫重塑。后续研究可在更大队列中结合多时间点纵向采样，结合空间组学验证关键细胞在腹膜转移灶的原位分布，并通过体外功能实验或动物模型对关键通讯轴等进行机制验证，以进一步明确IPC诱导免疫重塑的时序特征及其与疗效预后的关联。
研究从基因、通路及免疫细胞组成功能层面，刻画了IPC前后腹膜免疫微环境的变化。
1）IPC后免疫微环境整体呈现效应增强与抑制减弱：bulk RNA-seq表明炎症/趋化与先天免疫通路上调；CIBERSORT与scRNA-seq一致显示CD8+T比例上调、Treg细胞比例下降，髓系抑制性作用减弱。
2）细胞通讯层面，CCL4−CCR5与NECTIN2−CD226轴在IPC后权重上升，提示效应T细胞募集、驻留及细胞毒性功能可能被加强。
综上，IPC可能通过增强效应T细胞活性及减弱髓系抑制功能，提示腹膜免疫微环境发生部分重塑，上述发现为优化局部干预与免疫联合策略提供转录组学依据。
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