ACS Sens：用于前列腺癌早期筛查的超灵敏级联酶免疫分析电化学微流控芯片

      免疫传感器因其高灵敏度、高特异性和小型化潜力，在癌症诊断领域展现出巨大前景。然而，传统电化学免疫传感器通常依赖单步酶反应和单生物标志物检测，这限制了其信号放大能力和对前列腺癌等复杂疾病的诊断准确性。在此，本研究提出了一种超灵敏级联酶免疫分析电化学微流控芯片（CEE-CHIP），用于多种前列腺癌生物标志物的同步检测。该系统采用一抗功能化的磁性金属有机框架（Fe₃O₄@MOF），随后目标抗原特异性结合，葡萄糖氧化酶标记的二抗偶联形成稳定的夹心免疫复合物。功能化的Fe₃O₄@MOF通过磁场定位于微流控通道内，随后由葡萄糖氧化酶催化的级联反应生成H₂O₂，H₂O₂被Co₃O₄/MXene修饰的工作电极检测，产生放大的电化学信号。该系统可实现多种肿瘤标志物的同步检测，包括前列腺特异性抗原和Engrailed 2，检测限分别低至0.154和0.146 pg/mL。凭借宽线性范围（0.001–100 ng/mL）、优异的灵敏度和极低的样本消耗量，CEE-CHIP代表了一种有前景的非侵入性、即时诊断平台，可用于前列腺癌早期检测及更广泛的临床应用。

图 1. 用于前列腺癌肿瘤标志物早期筛查的超灵敏级联酶免疫分析微流控芯片示意图。（a）微流控芯片制作示意图：在基底上沉积 Pt/Cr 层后，图案化电极并修饰 Ag/AgCl 和 Co₃O₄/MXene，随后进行芯片键合。（b）多孔 Fe₃O₄@MOF 纳米粒子的功能化：一抗（Ab）首先固定在 Fe₃O₄@MOF 表面，并用 BSA 封闭非特异性结合位点；随后目标抗原（Ag）与抗体特异性结合；最后，葡萄糖氧化酶标记的二抗（Ab-GOx）偶联以完成免疫夹心结构，形成 Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag/Ab-GOx。（c）级联酶免疫分析的操作流程：首先将样本加载至微流控通道中；在磁场作用下，Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag/Ab-GOx 复合物形成并被磁力捕获于通道底部；随后引入葡萄糖，GOx 催化其转化为 H₂O₂，H₂O₂ 被 Co₃O₄/MXene 修饰的工作电极检测，产生放大的电流信号；通道可被刷新以用于重复或多重检测。

图 2. 芯片工作电极的形貌组分表征以及抗体接枝材料的形貌组成与性能表征。（a）Co₃O₄/MXene 的 SEM 图像；（b）Co₃O₄/MXene 的 TEM 图像及 Ti、Co、O 的 EDS 元素面分布图；（c）Co₃O₄/MXene 的高分辨 TEM 图像；（d）Ti₃AlC₂、Ti₃C₂Tₓ、Co₃O₄ 和 Co₃O₄/MXene 的 XRD 谱图；Co₃O₄/MXene 的 XPS 光谱：（e）全谱，（f）Co 2p 区域，（g）Ti 2p 区域；（h）Fe₃O₄@MOF 的 SEM 图像和（i）FTIR 光谱；（j）Fe₃O₄ 和 Fe₃O₄@MOF 的磁滞回线，插图为 Fe₃O₄@MOF 磁分离能力展示；（k）Fe₃O₄@MOF 的孔径分布；（l）Fe₃O₄@MOF 表面抗体的荧光图像；（m）接枝抗体后 Fe₃O₄@MOF 的紫外-可见吸收光谱；（n）A（Fe₃O₄@MOF）、B（Fe₃O₄@MOF/Ab）、C（Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA）、D（Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag）、E（Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag/Ab-GOx）的 CV 曲线和（o）Nyquist 图。

图 3. Co₃O₄/MXene 检测 H₂O₂ 的电化学性能。（a）GCE、Co₃O₄/GCE、MXene/GCE 和 Co₃O₄/MXene/GCE 在含 10 mM H₂O₂ 的 0.1 M KCl 溶液中的 CV 曲线；（b）Co₃O₄/MXene 在不同 H₂O₂ 浓度下的 CV 曲线，插图为对应的校正曲线；（c）Co₃O₄/MXene 在不同施加电位下、于 0.1 M KCl 溶液中连续注入 0.2 mM H₂O₂ 的计时电流响应；（d）为（c）对应的校正曲线；Co₃O₄/MXene 在 0.1 M KCl 溶液中对连续加入（e）低浓度和（f）高浓度 H₂O₂ 的计时电流响应，插图为注入 H₂O₂ 后响应时间的放大图像；Co₃O₄/MXene 响应电流与不同 H₂O₂ 浓度之间的线性关系：（g）0 至 1500 μM 和（h）1.5 至 30 mM；（i）Co₃O₄/MXene 在 –0.35 V 电位下，于 0.1 M KCl 溶液中连续注入 0.1 mM H₂O₂、5 mM 葡萄糖（Glu）、尿酸（UA）、尿素（U）、NaCl 和 0.1 mM H₂O₂ 的计时电流响应。

图 4. 微流控电化学芯片用于前列腺癌肿瘤标志物检测的性能。 （a）芯片在连续通入不同溶液时的电化学电流信号变化；（b）夹心模型不同阶段（A：Fe₃O₄@MOF，B：Fe₃O₄@MOF/Ab，C：Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA，D：Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag，E：Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag/Ab-GOx）通入葡萄糖溶液时的信号变化；（c）不同浓度 PSA 的检测信号 i–t 曲线；（d）PSA 检测的标准曲线；（e）不同浓度 EN2 的检测 i–t 曲线；（f）EN2 检测的标准曲线；（g）PSA 检测的特异性和（h）EN2 检测的特异性；（i）微流控电化学芯片的长期稳定性；（j）芯片重复检测 1 ng/mL PSA 的信号值（清洗后的电流值与检测时的电流值）；（k）芯片检测后工作电极在 1×PBS 溶液中的 Nyquist 图和（l）阻抗值。

图 5. 微流控电化学芯片对临床尿液样本中肿瘤标志物的检测性能。 （a）临床样本检测流程图；（b、c）样本 1–10 的 PSA 检测信号 i–t 曲线（1–5 号为前列腺癌患者，6–7 号为前列腺增生患者，8–10 号为健康志愿者）；（d、e）样本 1–10 的 EN2 检测信号 i–t 曲线；（f、g）CEE-CHIP 与商业化 ELISA 试剂盒在临床样本中检测（f）PSA 和（g）EN2 的能力对比。

     本研究旨在解决传统前列腺癌筛查方法特异性差、假阳性率高，以及现有电化学免疫传感器信号放大能力有限、难以实现多标志物联检等关键科学问题。为此，本研究设计并制备了一种新型级联酶免疫分析电化学微流控芯片。在材料层面，通过水热法合成了Co₃O₄/MXene纳米复合材料，透射电镜和X射线衍射表征证实了Co₃O₄纳米颗粒（直径约20–25 nm）在MXene纳米片上均匀分散，X射线光电子能谱进一步确认了Co²⁺/Co³⁺和Ti³⁺/Ti⁴⁺的共存，这种异质结构显著增强了材料的电催化和电子传输性能。同时，采用溶剂热法和逐层自组装策略制备了Fe₃O₄@MOF磁性多孔材料，傅里叶红外光谱证实了MOF壳层的成功包覆，磁滞回线显示其具有良好的超顺磁性，便于在微流控通道内进行磁操控和分离，荧光成像和紫外可见吸收光谱则验证了抗体在MOF表面的高效接枝。

     在传感机制方面，该芯片采用离线的逐级免疫组装策略：首先将目标抗原与Fe₃O₄@MOF/Ab复合物在管外孵育，形成Fe₃O₄@MOF/Ab/BSA/Ag/Ab-GOx完整夹心结构后，再将其引入微流控芯片通道并在磁场作用下固定于工作电极区域。随后注入葡萄糖溶液，固定化的GOx催化葡萄糖氧化生成H₂O₂，H₂O₂在Co₃O₄/MXene修饰电极上发生电化学还原产生电流信号。循环伏安和计时电流实验表明，该电极对H₂O₂的检测在0至1.5 mM和1.5至30 mM两个浓度范围内均呈现良好线性，检测限低至0.196 μM，响应时间仅1.5秒，且对葡萄糖、尿酸、尿素和氯化钠等常见干扰物几乎无响应，相对标准偏差优于1.63%，展示出优异的灵敏度、选择性和重复性。

      在分析性能评估中，该芯片对PSA和EN2的检测线性范围均覆盖0.001至100 ng/mL，回归方程分别为γ(μA) = -8.43lgC_PSA - 33.58和γ(μA) = -9.50lgC_EN2 - 36.71，相关系数均为0.99。特异性实验表明，即使BSA和EpCAM等干扰蛋白浓度远高于目标物，芯片仍仅对PSA和EN2产生显著信号响应。重复使用性实验显示，芯片在7次连续检测中信号保持稳定，且微流控通道具备良好的抗污染能力。长期稳定性测试表明，芯片在30天内仍可保持初始信号的95.33%。

     最为关键的是，作者将该芯片应用于临床尿液样本检测。通过对5例前列腺癌患者、2例前列腺增生患者和3例健康志愿者的样本分析，发现该芯片检测的PSA和EN2浓度与商业化ELISA试剂盒结果高度一致，且在前列腺增生患者中EN2水平仍处于正常范围，提示双标志物联检有助于降低PSA筛查的假阳性率。加标回收实验中，芯片在人工尿液中的回收率为97.3%–106.5%，相对标准偏差小于9.01%，验证了其在复杂生物基质中的准确性和可靠性。综上所述，该芯片通过“磁性MOF高效富集—GOx级联酶催化—Co₃O₄/MXene协同信号放大”的逐级增强策略，实现了对前列腺癌相关标志物的超灵敏、高特异性和多靶标同时检测，其成本可控、操作简便且具备可规模化生产的潜力，为前列腺癌早期无创筛查和更广泛的个性化精准诊断提供了极具前景的技术平台。

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