环状适配体：食品、环境、医疗领域的"识别利器"

核酸适配体（简称适配体）是一类通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）经体外筛选得的功能性寡核苷酸分子。适配体通常是单链（SS）脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）分子。近年来，传统线性适配体在生物传感、靶向治疗等领域展现出应用潜力，然而，其自身存在的热力学稳定性欠佳以及易受生物样本中大量存在的核酸外切酶降解等问题，制约了其在实际应用中的可靠性。天然环状RNA因其独特的闭环结构而展现出更优的核酸外切酶抗性和热力学稳定性。受此启发，研究者通过仿生设计和精准的化学合成，将现有线性适配体环化，或者利用SELEX技术直接筛选获得环状适配体。这不仅提高了适配体稳定性与生物活性，更为开发适用于复杂生物体系的分子探针奠定了基础。

1.1 环状适配体合成方法

为增强适配体在复杂生物基质中的结构稳定性与靶向识别功能，研究者通过分子拓扑学设计开发了2种主要环化策略：生物酶催化连接和化学连接（图1）。传统的生物酶催化环化策略通过DNA连接酶催化连接两段黏性末端，形成哑铃状环状DNA。然而，该方法需要额外设计特定长度的碱基互补配对来满足黏性末端的需求，不利于DNA序列的充分利用，且难以用于构建环状小哑铃结构。近年来发展出ssDNA模板导向连接技术，通过连接模板将线性DNA两段拉至相邻，提高了环化反应的特异性与效率。然而，由于连接模板对于相同序列的等效识别能力，造成分子间的识别和连接，影响合环效率和产品纯度。相较而言，化学连接环化策略则有效规避了酶依赖性与模板限制，凭借其连接反应的高效性与高选择性，以及分子设计的灵活性脱颖而出，通过合理设计可实现环化产物的快速和规模化制备。

图1 环状适配体制备方法

1.2 环状适配体的生物学特性

相较于抗体，适配体在免疫原性、化学合成可控性、热稳定性及化学修饰灵活性等方面表现出显著优势。然而，传统线性适配体在实际应用中面临双重瓶颈：

• 其一，其动态构象易受复杂生物基质中异质性组分干扰，导致功能性结合界面掩蔽或构象改变；

• 其二，线性单链核酸的裸露末端易受核酸外切酶攻击而发生降解，导致适配体的功能半衰期显著缩短。

环状适配体通过共价闭合的拓扑结构改造，系统性解决了上述技术挑战问题。如表1所示，在完全保留线性适配体识别能力的基础上，环状适配体的结构特性实现了3方面技术突破：

（1）优异的生物稳定性。

（2）较强的热力学稳定性。

（3）与滚环扩增（RCA）技术的高度兼容性。

表1 环状适配体、线性适配体和抗体的比较

2.1 SELEX技术

SELEX技术通过迭代筛选实现适配体的定向进化，其核心流程可系统划分为以下关键步骤（图2）。首先，将靶标分子与随机文库在优化设计的反应体系中进行孵育，将能够与靶标结合的候选核酸序列与未结合的序列分离。然后，将分离获得的产物进行富集扩增。经过5~15轮的循环，通过高通量测序结合生物信息学分析对筛选产物进行序列分析，鉴定高潜力候选序列并分析其亲和力和特异性，最终挑选出效果最优的适配体序列。基于上述典型的SELEX流程，近年衍生出多种创新性的适配体筛选策略（图2）。

图2 4种典型的SELEX方法流程

2.2 环状适配体的高效筛选

环化为适配体带来结构上的稳定，但也有可能降低原有线性适配体的识别功能，直接筛选环状适配体无疑成为了解决方案。Liu等首次尝试以环状DNA文库进行适配体筛选，成功分离出2条针对艰难梭菌谷氨酸脱氢酶不同表位的特异性环状适配体（图3（a））。郑磊教授团队建立了一种non−PCR的应用环境导向型环状适配体筛选策略（图3（b）），成功获得在复杂基质中具有极佳识别性能的凝血酶环状适配体。基于模块化设计理念，筛选出的双特异性环状适配体能够同时识别IL−6及其受体并有效阻断其结合（图3（c））。进一步提出了结合位点导向的环状适配体筛选策略（图3（d）），成功筛选出具有凝血因子特异性抑制功能的环状适配体，解决了当前环状适配体合成效率低的问题。针对复杂基质中的应用场景，设计构建了多价环状文库，显著提高了环状适配体在食品复杂基质中的抗干扰能力（图3（e））。针对小分子靶标筛选瓶颈，进一步发展了基于磁性氧化石墨烯高效快速分离的环状适配体筛选策略（图3（f）），成功获得焓熵协同驱动的高亲和力黄曲霉毒素B₁环状适配体。

图3 环状适配体高效筛选

2.3 单轮筛选

为提高SELEX的筛选效率，研究者针对适配体的高效分离与富集提出了单轮筛选策略。Berezovski等首次实现了单轮筛选即可获得纳摩尔级亲和力的蛋白质法尼基转移酶适配体（图4（a））。随后，Le等进一步优化毛细管电泳技术，显著提高了蛋白靶标结合适配体的分离效率（图4（b））。Lou等开发了基于微流控芯片的单轮筛选平台，实现了重组a型肉毒毒素轻链适配体的快速、高效、自动化筛选（图4（c））。Saito等建立了凝血酶适配体的单轮筛选策略（图4（d））。Bawazer等成功实现了生物矿化DNA适配体的高效分离（图4（e））。Wu等实现了低丰度细胞表面蛋白适配体的高效单轮筛选（图4（f））。Singh等成功富集出高性能蛋白结合适配体（图4（g））。Yao等成功获得了花生过敏原、脂多糖、黄曲霉毒素的环状适配体（图4（h））。

图4 单轮筛选

近年来，环状拓扑结构在适配体研究领域取得了显著进展。Di等尝试将多种适配体首尾相连构建多价环状适配体，有效提高了适配体在血液中的半衰期（图5（a））。谭蔚泓团队构建了多种功能性二价环状适配体（图5（b））；同步靶向肿瘤细胞与T细胞的二价环状适配体（图5（c））；增强血脑屏障穿透的神经退行疾病治疗二价环状适配体（图5（d））；实现膜蛋白溶酶体靶向降解动态调控的二价环状适配体（图5（e））；实现体内高效肿瘤治疗的多价环状适配体（图5（f））。Dong等设计了靶向循环肿瘤细胞的环状适配体，可在小鼠体内和人血清中高效捕获靶向循环肿瘤细胞并促使其凋亡（图5（g））。Litke等利用自催化转录本在细胞中高效表达环状RNA适配体实现细胞功能调控和低表达蛋白荧光成像（图5（h））。

图5 环状适配体结构设计

适配体对靶标的识别和结合能力主要源于其折叠结构与靶标构型的匹配程度，因此，折叠能量是评价适配体功能性和稳定性的重要参数。郑磊团队开发了双链DNA“分子力钳”技术（图6（a）），该技术通过机械拉伸扰动适配体分子构象，结合延时凝胶电泳方法，实现了平衡状态下适配体折叠能量的精确测定。进一步研究发现，通过调控“分子力钳”施加的机械张力，实现亲和力在65倍范围内的可逆调节（图6（b））。此外，团队还发现经 “分子力钳”调控，可使赭曲霉毒素A适配体亲和力实现2倍范围调节（图6（c））。基于此技术优化的适配体荧光探针，其检测灵敏度较传统探针提升了16倍。

图6 适配体性能调控

RCA是一种基于环状模板的高效等温核酸扩增技术。近年来，通过将线性适配体环化构建功能性RCA模板，或直接利用天然环状适配体进行RCA反应放大传感信号，提高了生物分子检测灵敏度，并成功开发出兼具高特异性与功能可编程性的核酸探针，已广泛应用于疾病诊断、细胞成像及靶向药物递送系统构建等领域。

4.1 环状适配体结合滚环扩增技术在生物传感中的应用

与RCA技术的联合应用已成为环状适配体生物传感领域的重要研究方向。Di等开发出“双适配体邻近延伸”策略（图7（a）），成功实现凝血酶的实时检测。Yang等提出单适配体驱动的构象转换机制（图7（b）），成功实现了细胞裂解液中血小板衍生生长因子的检测。Wang等开发出基于靶标结合RCA阻滞效应的检测策略，成功实现凝血酶的可视化检测（图7（c））。基于此原理，郑磊团队实现了痕量黄曲霉毒素B1的精准检测（图7（d））。进一步利用靶标竞争释放策略将游离适配体转化为RCA 模板，建立了高灵敏花生过敏原检测平台（图7（e））。Xu等将Ni²⁺适配体环化并与RCA技术结合，实现了废水中Ni²⁺的有效吸附（图7（f））。

图7 环状适配体结合滚环扩增技术在生物传感中的应用

4.2 滚环扩增生成的多价适配体在生物医学中的应用

环状模板等温扩增机制可用于实现多价适配体的精准合成与拓扑结构调控。该技术可通过设计优化模板反义序列，实现适配体重复单元数目、空间排布及价态分布的精确调控，从而增强多价适配体与靶标分子的结合亲和力及特异性。Cheglakov等率先利用RCA技术验证了多价效应与空间匹配性对分子识别动力学的协同增强作用（图8（a））。Zhao等通过原位RCA合成酪氨酸激酶-7多价适配体网络，实现了淋巴母细胞的高效捕获与可控释放（图8（b））。此外，借助RCA技术制备的多价适配体可进一步拓展至小分子污染物及循环肿瘤细胞的痕量富集分析（图8（c））。Zhu等与Zhang等研发出RCA自组装多价适配体纳米花，该材料兼具阿霉素靶向递送与多模态细胞成像功能（图8（d））。Song等利用RCA技术自组装生成了大小形态可控的DNA水凝胶（图8（e））。Zhang等进一步利用该技术发展了含有多价适配体的靶标响应性DNA水凝胶以用于癌症免疫治疗（图8（f））。

图8 RCA生成的多价适配体在生物医学中的应用

环状适配体凭借其闭环拓扑结构赋予的功能稳定性、抗核酸外切酶降解特性及与RCA技术的兼容性，在环境监测、食品安全及疾病诊断等领域展现出重要应用价值。然而，当前技术仍受限于低效的化学合成工艺、三维构效关系解析体系匮乏、靶标识别位点动态作用机制不明确等瓶颈，导致理性设计能力不足，难以满足规模化靶标识别需求。此外，现有筛选模型对复杂基质与适配体构象互作的动态影响缺乏系统性研究，严重制约其实际应用效能。未来研究工作可从以下3个方面进行深入开展：

5.1 环化技术发展策略：提高环化效率与纯度

未来可通过宏基因组挖掘或蛋白质定向进化技术开发高特异性、高热稳定性的新型连接酶；设计光裂解或限制性内切酶敏感型模板，利用光控或酶促降解实现模板残留的高效清除；构建基于微流控芯片的连续化反应体系，通过微尺度流体动力学精准调控温度、离子浓度及反应时间，从而抑制多聚或线性副产物生成并实现连续化、规模化合成。通过以上3方面协同推进，环状适配体有望克服合成瓶颈，在环境监测、食品安全及疾病诊断等领域展现更广阔的应用潜力。

5.2 构效关系解析与理性设计策略：从经验筛选到精准预测

未来可聚焦于利用深度学习驱动的分子动力学模拟来解析环状适配体动态折叠轨迹，从而构建环状适配体序列、构象与亲和力之间的多维映射模型，实现靶标结合模式的精准预测和适配体结构域自由能景观的优化。在此基础上，可进一步借助人工智能辅助技术对靶标关键识别位点的预测和优化，自下而上地设计并构建多类型靶标的环状适配体元件库。进一步融合高通量微流控芯片与表面等离子体共振光谱等实时监测技术，建立人工智能预测、自动化合成与功能验证流程下的环状适配体优化体系，为生物传感系统提供高性能分子识别工具，最终实现复杂基质中多类型靶标的快速筛查与精准预警。

5.3 环状适配体在复杂环境下的筛选与功能验证：挑战与策略优化

构建仿生梯度筛选体系，通过整合动态多相微环境模块，如梯度变化的模拟食品基质、全血稀释液或肿瘤细胞外基质，在SELEX筛选过程中引入可控环境应力，如pH值变化、剪切力扰动，以模拟真实应用场景的分子互作网络。同时，可耦合微生理系统，建立定向筛选平台，获得对复杂基质干扰具有构象抗性的高性能环状适配体。此外，可建立统一的环状适配体筛选、生产与质控标准，规模化生产工艺，推动环状适配体筛选、生产与临床评价的规范化，加速推动环状适配体从实验室基础研究向产业化应用转化。

适配体作为新型分子识别元件，凭借其优异的化学稳定性、可编程修饰特性和规模化制备优势，在环境监测、食品安全、疾病诊断以及药物设计等领域展现出广阔应用前景。

与此同时，环状适配体技术的发展仍面临多重瓶颈：化学合成工艺中环化效率与产物纯度不稳定、三维空间构效关系解析体系尚未建立、靶标识别位点的动态作用机制尚未阐明、现有筛选模型过度依赖单一实验体系，特别是对复杂基质与适配体构象动态互作的系统性研究仍存在显著空白。

在此提出3个核心研究方向：通过优化环化反应体系提高合成效率与产物均一性；构建人工智能驱动的环状适配体与靶标构效关系解析平台；以及发展面向复杂基质互作解析的动态筛选模型。旨在突破现有技术限制，增强环状适配体在复杂微环境中的构象适应性和功能可编程性，最终实现其在生物传感与临床治疗中的转化应用。