Biosens Bioelectron：基于亲和肽的微流控电化学系统用于淀粉样β肽的超灵敏检测

     阿尔茨海默病（AD）是全球痴呆症的首要病因，其病程隐匿、不可逆，确诊时往往已错过最佳干预窗口。Aβ40和Aβ42是AD核心生物标志物，但其在外周血中丰度极低，浓度接近部分免疫分析法的检测下限；同时Aβ亚型间序列高度同源、易形成可溶性聚集体，导致抗体交叉反应和质谱信号掩蔽。现有ELISA、SiMoA和LC-MS/MS等方法难以兼顾超灵敏、高特异与自动化，外周血Aβ检测仍是AD早筛的瓶颈。针对这一迫切需求，本研究从噬菌体展示库（1000亿变体）中经三轮消减淘选获得Aβ40和Aβ42的高亲和配对肽，分别作为三明治识别的捕获与检测探针。检测探针通过Ag-S键偶联于银纳米颗粒（AgNPs），捕获探针经PBASE固定于激光诱导石墨烯（LIG）电极；靶标存在时形成三明治复合物，将AgNPs锚定于电极表面，电化学氧化产生可测峰电流。进一步将传感器与两层微流控芯片集成，构建μF-APEC系统，实现自动进样、片上蛇形通道混匀与电化学读出，全程<20分钟，旨在为AD早期筛查提供超灵敏、高特异、自动化的外周血检测平台。

• 噬菌体展示筛选高亲和配对肽：从1000亿变体库中经三轮消减淘选获得Aβ40（A1/A2，KD 13/420 nM）和Aβ42（P1/P2，KD 2.2/22 nM）配对肽，分子对接与突变体实验证实二者分别识别靶标的不同结构区域，为三明治识别奠定基础。

• 微流控集成实现自动化快速检测：蛇形微通道配合矩形扰动结构，混合效率达97%，全程自动进样、混匀与电化学读出，检测时间<20分钟，样本量仅8 μL。

• 超灵敏检测与临床验证：Aβ40和Aβ42检测限分别达38 fg/mL和14 fg/mL，线性范围100 fg/mL–1 ng/mL；30例临床血清样本与ELISA一致，AD患者Aβ42/Aβ40比值显著低于健康对照。

  
  

图1.（A）基于亲和肽的电化学生物传感器检测原理示意图：一对Aβ特异性亲和肽分别作为检测探针和捕获探针，靶标存在时形成三明治复合物，将AgNPs锚定于电极表面，电化学氧化产生可测峰电流。（B、C）μF-APEC系统示意图：上层蛇形微通道用于样品与检测探针混合并输送至LIG电极，下层腔室容纳LIG电极，出口与工作电极中心精确对齐。

图2. （A）针对Aβ40特异性肽的消减噬菌体展示生物淘选示意图。（B、C）候选肽对针对Aβ40（B）和Aβ42（C）的结合信号比较。（D、E）所选肽对针对Aβ40（D）和Aβ42（E）的选择性评估。（F–I）BLI测得的肽A1（F）、A2（G）、P1（H）和P2（I）的结合与解离动力学曲线。（J、K）A1/A2与Aβ40（J）及P1/P2与Aβ42（K）的分子对接模型。（L、M）亲和肽与相应突变体Aβ变体的亲和力。亲和力（%）= 1/[KD,变体/KD,Aβ] × 100%。N、C、M分别代表N端、C端和中间区域突变体。误差棒为三次独立实验（n=3）的SD。

图 3. （A）AgNPs逐步功能化的FTIR光谱。（B–E）肽偶联后AgNPs的XPS谱：N 1s（B、C）和C 1s（D、E）。（F、G）LIG电极逐步修饰的EIS Nyquist图。（H、I）LIG电极逐步修饰的CV曲线。

图 4（A）混合通道中的模拟浓度分布。（B）微流控芯片中十个所选截面的示意图。（C）十个截面处的模拟浓度分布。（D）（B）中各截面的混合效率。（E）RhB流经微通道的荧光图像。比例尺：500 μm。（F）（B）中各截面的相对荧光强度，归一化为含RhB入口处强度。（G–J）μF-APEC系统中HS-PEG-COOH（G）、检测肽（H）、PBASE（I）和捕获肽（J）浓度的优化。误差棒为（F）中三次独立实验（n=3）和（G–J）中六次独立实验（n=6）的SD。

图 5. （A、B）Aβ40（A）和Aβ42（B）在一系列浓度下的代表性DPV曲线。（C、D）Aβ40（C）和Aβ42（D）的线性校准曲线。（E、F）μF-APEC系统对Aβ40（E）和Aβ42（F）的选择性评估。Aβ-O和Aβ-F分别代表Aβ寡聚体和Aβ纤维，测试浓度均为100 pg/mL。HSA、IgG和TF测试浓度分别为35、7和2 mg/mL。误差棒为（C、D）中六次独立实验（n=6）和（E、F）中三次独立实验（n=3）的SD。

图 6. （A、B）人工血清中Aβ40（A）和Aβ42（B）定量的线性校准曲线。（C）ELISA与μF-APEC测量的相关性分析。（D）ELISA和μF-APEC测得的健康个体与AD患者Aβ42/Aβ40比值比较。误差棒为（A、B）独立实验（n=6）和（D）独立实验（n=15）的SD。

      本研究构建了基于亲和肽的微流控电化学系统（μF-APEC）。该系统以噬菌体展示筛选的配对肽为三明治识别元件，以AgNPs为电化学信号标签，以LIG电极为传感界面，并集成了蛇形微流控通道实现自动进样、片上混匀与电化学读出。在优化条件下，Aβ40和Aβ42的检测限分别低至38 fg/mL和14 fg/mL，线性范围均为100 fg/mL–1 ng/mL，全程检测时间<20分钟，样本量仅8 μL。在30例临床血清样本中，μF-APEC与ELISA结果高度一致，AD患者Aβ42/Aβ40比值显著低于健康对照，加标回收率为88%–106%，RSD为3.25%–7.19%。该工作将高亲和肽识别、电化学信号放大与微流控自动化相结合，为低丰度外周血Aβ肽的检测提供了可行平台，也为AD早期筛查与疾病监测的临床转化奠定了基础。

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