Microchem J：缺陷调控多孔碳稳定Pt-N4位点增强类漆酶活性及其在木犀草素检测纳米酶传感器中的应用

酚类污染物在环境中降解缓慢，可通过皮肤和粘膜迅速进入人或动物体内，损害中枢神经系统、肝脏和肾脏，甚至诱发高铁血红蛋白血症。而多酚化合物虽然由于其抗氧化、抗炎和抗癌特性而经常用作治疗剂，但是其不当使用时也会引发不良反应。因此，实现复杂生物基质中多种酚类化合物的超灵敏检测至关重要，亟需开发快速响应且高灵敏度的检测平台。

纳米酶克服了天然酶在稳定性和应用范围上的局限性，可以有效地应用于比色、荧光和电化学系统中多种信号转导机制。近年来，模拟漆酶的纳米酶已成为酚类化合物检测的极有前途的候选物，其中基于铂的纳米材料已经显示出了优异的类漆酶催化潜力。而单原子纳米酶通过在精确设计的协调环境中分散原子中心，最大限度地提高了原子利用率。然而，孤立原子的热力学不稳定性在合成过程中会导致显著的金属聚集。因此迫切需要具有明确缺陷结构和均匀形貌的创新载体材料。值得注意的是，具有有序结构和可调孔隙率的三维中空碳材料为单原子固定化、微环境调节和催化活性优化提供了一种有前景的方法。因此，采用缺陷工程策略构建的3D中空碳框架，不仅能够实现铂（Pt）单原子的高度分散，还可有效维持其优异的催化性能，展现出显著的应用潜力。

本研究采用缺陷工程碳载体和Pt-N4配位的策略合成了具有类漆酶活性的Pt单原子纳米酶（Pt-HNC3-800）。这种策略不仅提高了传质效率，而且能够对Pt中心进行电子调制以优化底物亲和性。Pt-N4位点赋予Pt-HNC3-800卓越的催化效率（K_cat/K_m = 27.2 mM⁻¹ min⁻¹）和强大的环境适应性，在暴露于可变pH值（5-9）和温度（27-77℃）8天后仍可维持89%的催化活性。在快速比色预筛选的基础上，基于木犀草素（LU）的特征峰电位识别成功地研制了电化学传感器。该传感器实现了对LU的超灵敏检测，其浓度范围为0.3 nM-80 μM（LOD = 0.16 nM，S/N = 3）。密度泛函理论（DFT）计算进一步揭示，缺陷工程化的Pt-N4位点通过优化半醌自由基生成降低了酚类底物氧化的活化能垒。在金银花、独一味胶囊和山楂提取物中的实际验证表明，回收率为91.7%-110.8%，突出了其对复杂基质的可靠性。该研究不仅为原子位点工程化设计模拟酶（SAzymes）建立了普适性范式，更开创性地拓展了其在食品质量快速检测与生物医学精准诊断领域的创新应用。

• 材料性能改善：

  通过鞣酸刻蚀与高温煅烧策略构建了三维氮掺杂空心碳框架，采用空间限域策略将铂原子以Pt-N4配位形式高度分散于碳骨架中，原子利用率接近100%；Pt-HNC3-800在宽pH范围(5-9)和高温(27-77℃)条件下保持89%的催化活性，且耐受高盐、乙醇等复杂介质，突破了天然酶的稳定性限制。

• 传感性能优异：

  对木犀草素（LU）的检测范围达0.3 nM-80 μM，检出限低至0.16 nM（S/N=3），优于多数报道的酚类检测方法；在金银花、山楂提取物及胶囊样品中实现高回收率（91.7%-110.8%），与HPLC结果一致，展现出可靠的临床与食品安全检测潜力。

• 理论计算与机理突破：

  计算表明Pt-N₄位点通过优化电子结构降低反应能垒（O-H键断裂能垒从-1.57 eV降至-0.54 eV），加速半醌自由基生成，提升催化效率；LU氧化遵循2e⁻/2H⁺机制，Pt-HNC3-800通过稳定中间态并促进电子传递，实现高效电化学信号输出。

  
  

图1. Pt-HNC3-800合成示意图。

图2. （A）pZIF-8、（B）HNC3-800和（C）Pt-HNC3-800的SEM图；（D）Pt-HNC3-800的HAADF-STEM图像和（E）伪彩色图像；（F）Pt-HNC3-800的EDS图像；Pt-HNC3-800的（G）Pt L₃边XANES光谱和（H）傅里叶k²加权广延EXAFS图（以Pt箔和PtO₂作为参比）；（I）Pt-HNC3-800的相应EXAFS R空间拟合曲线；（J）Pt箔、（K）PtO₂和（L）Pt-HNC3-800的k²加权Pt L₃边EXAFS光谱的小波变换。

图3. （A）4-AP和2, 4-DP在不同体系中的反应机理示意图；（B）Pt-HNC3-800与天然漆酶催化活性的比较；（C）Pt-HNC3-800纳米酶对于2, 4-DP和4-AP反应体系的相对活性的柱状图（反应体系分别受到2mg mL⁻¹ IPA、FFA、EDTA⋅2Na和CHCl₃的影响）；（D）不同系统的ESR测试；（E-G）Pt-HNC3-800和漆酶的稳态动力学和Lineweaver-Burk图；（H）Pt-HNC3-800纳米酶的类漆酶活性机制示意图。

图4. 不同浓度下（A）LU、（B）BPA和（C）2, 4-DP的UV吸收光谱及其相应的校准曲线（D-F）。

图5. 裸GCE、pZIF-8/GCE、HNC3-800/GCE和Pt-HNC3-800/GCE在含有50 μM LU的0.1 M PBS（pH 6）中的（A）CV曲线和（B）相应的i_pa直方图；（C）不同扫描速率（0.01-0.19 V s⁻¹）下Pt-HNC3-800在含50 μM LU的0.1 M PBS中的CV曲线；（D）i_pa、i_pc和ν^1/2之间的线性关系图；（E）E_pa、E_pc和lnν之间的线性关系图；（F）Pt-HNC3-800/GCE在含有50 μM LU的不同pH值（4.0-8.0）的0.1 M PBS中的DPV曲线；（G）不同pH值下含50 μM LU的0.1 M PBS中Pt-HNC 3800/GCE的i_pa和E_pa；（H）E_pa与pH的线性关系图；（I）LU的质子耦合电子转移机理。

图6. （A）LU在HNC3-800和Pt-HNC3-800上氧化反应的自由能计算以及（B）LU在Pt-HNC3-800纳米酶上的电化学反应机理；（C）在0.1 M PBS中Pt-HNC3-800/GCE上，浓度范围为80 pM至80 μM的LU的DPV曲线；（D）阳极峰电流与LU浓度的线性关系图；Pt-HNC3-800/GCE系统的（E）选择性、（F）重现性、（G）重复性和（H）稳定性。

本研究成功构建了一种基于缺陷工程的无铜漆酶模拟纳米酶（Pt-HNC3-800），并通过UV-Vis和电化学方法验证了其类漆酶活性。UV-Vis实验证实，Pt-HNC3-800能有效模拟天然漆酶的活性，同时克服了其在苛刻条件下的局限性，表现出优异的重复使用性。此外，Pt-HNC3-800对多种酚类化合物的降解表现出多功能催化性能，其中对LU催化氧化的效果尤为突出。利用Pt-HNC3-800的特性，研制了一种检测LU的电化学传感器。该传感器对LU具有较宽的线性检测范围和低检测限0.28 nM（S/N = 3）。此外，它还具有出色的选择性、重现性和出色的检测能力，可用于测定真实的样本中的LU。本研究为无铜漆酶模拟酶的设计提供了一种新的思路，为该酶在食品分析和生物催化领域的应用奠定了基础。

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