ACS Sens：拓扑调控的DNA在准三维rGO界面上的步行用于增强电化学卡那霉素传感

DNA行走器（DNA walker）是一种能够沿预设DNA轨道通过连续杂交-切割事件自主运动的分子机器，可将单个分子识别事件转化为放大信号，在生物传感领域备受关注。传统三维DNA轨道通常组装于纳米颗粒上，虽能通过局部限域效应提高行走器与轨道的连续相遇概率，但存在制备步骤繁琐、难以与平面电极平台集成等问题。

针对这一挑战，本研究提出了一种平面电极策略：利用还原氧化石墨烯（rGO） 固有的褶皱拓扑结构，在不依赖纳米颗粒组装的情况下，为DNA行走器提供准三维（quasi-3D）界面环境。研究团队构建了DNAzyme驱动、适配体锁定的DNA行走器，并在两个平台上进行对比：平坦CVD石墨烯上的传统二维DNA轨道与褶皱rGO上的准三维DNA轨道。实验结果表明，rGO的褶皱拓扑可缩短相邻DNA轨道之间的有效三维距离，提高行走器-轨道反复相遇的概率。rGO表面的探针密度（6.52×10¹² molecules cm⁻²）显著高于CVD石墨烯（3.39×10¹² molecules cm⁻²），表观行走器-轨道相互作用更强（Kd = 0.69 vs 7.62 fM），信号演化动力学快约27%。最终，准三维rGO传感器对卡那霉素的检测限低至8.66 aM，较二维CVD平台（0.52 fM）降低约60倍，并在加标牛奶样品中保持可靠性能（回收率92-101%）。该研究表明，电极表面拓扑可作为提升DNA行走器电化学生物传感性能的实用设计参数。

• 创新性提出"表面拓扑调控DNA行走"策略：利用rGO天然褶皱形貌构建准三维界面，将相邻DNA轨道限制在纳米级褶皱与脊线之间，缩短有效三维间距，提高行走器-轨道相遇概率，无需复杂纳米颗粒组装即可实现三维限域效果。

• 探针密度显著提升：计时库仑法测定表明，rGO表面DNA探针密度达6.52×10¹² molecules cm⁻²，约为CVD石墨烯（3.39×10¹² molecules cm⁻²）的2倍；共聚焦荧光与AFM成像进一步直观证实了rGO表面更致密的探针分布。

• 检测灵敏度实现飞摩尔至阿摩尔级跨越：准三维rGO传感器对卡那霉素检测限低至8.66 aM，较二维CVD平台（0.52 fM）降低约60倍，且线性范围更宽；与同表面非行走对照组（0.46 fM）对比，证实行走机制提供了超越静态识别的独特信号放大路径。

• 实际样品应用潜力：传感器对卡那霉素表现出优异选择性（可区分链霉素、四环素、氨苄青霉素等结构类似物），7天储存后信号保留96.8%，加标牛奶样品回收率达92-101%，具备实际应用前景。

  
  

Fig. 2 | 所制备界面的电化学表征。(A) CV曲线；(B) 奈奎斯特图；(C) Pb²⁺孵育后的时间依赖性奈奎斯特图；(D) 不同孵育时间下的SWV曲线。

Fig. 3 | DNA轨道/rGO-GCE与DNA轨道/CVD-GCE的电化学性能对比。(A) SWV峰电流随积累时间的变化；(B) SWV峰电流随孵育时间的变化；(C) 标准曲线；(D) SWV峰电流响应对比。

Fig.4|表观结合亲和力与表面探针密度。(A, B) 用于估算Kd,eff的Langmuir结合等温线；(C, D) DNA轨道/CVD-GCE和DNA轨道/rGO-GCE的计时库仑曲线。

Fig.5| DNA轨道/CVD (A) 和DNA轨道/rGO (B) 的共聚焦荧光图像。

Fig.6| CdS纳米颗粒标记的DNA行走器在DNA轨道/CVD-GCE表面的AFM图像：(A, C) Pb²⁺诱导孵育30分钟前；(B, D) 孵育后。

Fig.7|拓扑调控DNA行走器行为的界面模型示意图：平面二维CVD石墨烯界面与准三维褶皱rGO界面。

Fig.8|(A) 加入不同浓度卡那霉素后的SWV曲线；(B) 选择性评估；(C) 7天稳定性；(D) 五根独立制备电极的重现性评估。

      本研究通过对比DNAzyme驱动、适配体锁定的DNA行走器在平坦CVD石墨烯（二维轨道）与褶皱rGO（准三维轨道）两个平台上的运行行为，系统揭示了电极表面拓扑对表面受限DNA行走动力学的调控作用。计时库仑法测定表明，rGO表面支持的探针密度约为CVD石墨烯的2倍（6.52×10¹² vs 3.39×10¹² molecules cm⁻²），共聚焦荧光与AFM成像从视觉上进一步证实了褶皱rGO界面上更致密的探针堆积。在传感性能方面，准三维rGO平台在所有评价指标上均优于二维CVD平台：表观有效解离常数Kd,eff降低约11倍（0.69 vs 7.62 fM），表观速率常数kapp提升约27%，表明褶皱表面具有更强的行走器-轨道相互作用和更快的信号演化速率。这些优势最终转化为对卡那霉素8.66 aM的超低检测限，较CVD平台（0.52 fM）降低约60倍。与同rGO表面构建的非行走对照传感器相比，行走系统展现出显著更低的检测限和更高的信号输出，证实行走机制特有的反复杂交-切割循环提供了超越静态靶标识别的独特信号放大路径。值得注意的是，电化学活性面积分析表明rGO的ECSA约为CVD石墨烯的6倍，而探针密度仅提升约2倍，但传感性能改善幅度远超表面积比例，说明性能提升不能仅归因于表面积增大，而是源于褶皱拓扑创造的局部限域反应环境——该环境缩短了相邻轨道链之间的有效间距，提高了行走器连续相遇的概率，从而加速了随机行走过程。此外，该传感器对卡那霉素表现出良好的选择性、7天储存稳定性（信号保留96.8%）以及加标牛奶样品中的满意回收率（92-101%）。该策略为在平面电极平台上实现类三维限域效应提供了一条无需复杂纳米颗粒组装的简便途径，并确立了电极拓扑作为分子机器生物传感器功能设计参数的潜力。

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